NK-92細胞培養的注意事項

NK-92細胞特性

NK-92細胞生長特性為懸浮生長，收到細胞后先觀察瓶身是否完整，無漏液現象，培養基是否澄清透亮，在顯微鏡下觀察細胞；

用75%的酒精擦拭瓶身后將細胞培養瓶先豎立靜置2~4個小時，讓細胞沉降到底部；細胞靜置完后，將瓶中上面部分培養基小心吸出，留底部細胞和3ml左右培養基在原瓶；

吸出的細胞培養基離心收集細胞沉淀，離心轉速1000轉3分鐘，或根據您的離心機實際情況而定，NK-92細胞對離心敏感，轉速不宜過高；用2~3mlNK-92完培將得到的細胞沉淀重懸后，放回原瓶繼續培養過夜，一個T25培養體積是5~6毫升；

NK-92細胞可按照200U/ml的濃度補加IL-2。

培養瓶為不透氣瓶蓋，一定要擰松到不掉的程度，使細胞充分透氣；培養瓶橫放，瓶口擰松透氣，培養過夜；

顯微鏡下觀察細胞，視細胞密度和培養基消耗情況，進行傳代。不建議直接進行離心操作，因為經過運輸顛簸和各種處理，細胞很可能達不到最佳狀態。盡量不要吹散細胞團，加完液輕晃培養瓶即可。

細胞培養注意事項

NK-92細胞為懸浮生長，大部分細胞聚集成團，少數細胞分散，并且細胞間隙會有較多的死細胞和細胞碎片，且培養過程中經常能觀察黑色的顆粒和小黑點，這些黑點大概是細胞帶的，一般少量黑點不增殖不會影響細胞的生長，若黑點繁殖生長則懷疑細胞污染，會影響細胞生長，甚至使細胞死亡。

NK-92細胞對IL-2敏感。培養基中IL-2降解，將導致細胞狀態變差。IL-2長期保存溫度為-20℃，解凍后置于4℃冰箱保存，4℃保存不應超過兩周。配制好的新鮮培養基要盡快用完，使用前預熱，使用完畢后放回4℃冰箱保存；

NK-92細胞對離心敏感。正常培養時，換液周期為2~3天，建議交替使用半量換液和離心換液法，即半量換液2~3次后，離心全量換液一次。盡量減少離心次數，細胞狀態不佳或細胞量少的時候，一般不建議離心。

細胞團塊是否需要吹散？

團塊需要吹散，但不用刻意吹散成單顆；

正常傳代或者離心換液后吹打，控制吹打次數以及力度，即使細胞都分散成單個，也會在1~2天內聚集起來；細胞團太大時，需要分散；

細胞凍存的時候，細胞需要盡量分散，否則影響凍存效果。

換液方法
(1) 補液法：每2~3天補加適量（根據培養容器和原來細胞懸液體積來定，T25瓶一次補液1~2毫升即可）新鮮培養基，同時補加200U/mlIL-2，補加2-3次之后，離心全部換液。

(2) 半換液法：以T25瓶子（瓶中裝有5ml培養基）為例，豎起瓶子靜置一段時間（豎瓶前輕拍培瓶，讓輕貼底部的細胞團浮起來），待細胞沉底（肉眼觀察細胞沉底情況），小心吸出2.5ml上清轉移到離心管，1000rpm 3~5min離心，離心后的細沉淀用2.5ml新鮮培養重懸后放回原瓶繼續培養。細胞生長時，聚集的細胞團會逐漸增大，正常的細胞團在顯微鏡下呈現白色透亮狀。若細胞聚集太多，出現細胞團中部發暗時，可進行傳代。

傳代方法

將細胞團用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可過大，否則會出現大量死細胞和細胞碎片），均分到兩個瓶子里，每瓶再補充等量培養基。細胞對營養要求很高，細胞量過多時會影響細胞生長；細胞團塊過大時，需要稍微吹散，注意控制吹打次數，不需要全部吹散。

細胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比，NK-92細胞可適量補加IL-2；盡量吹散細胞，注意控制吹打力度。

細胞復蘇

復蘇后，用6ml新鮮培養基，重懸細胞；離心后去除上清用1~2mL培養基重懸細胞，注意要少次輕柔吹打。
瓶子豎著放進培養箱，以增加細胞局部密度，瓶蓋保持透氣；
細胞生長需要穩定的環境，可每天觀察1次，不要頻繁拿出培養箱觀察